Carbon and nitrogen isotope analysis of large yellow croaker tissues: The impact of pretreatments
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摘要: 碳氮稳定同位素组成（δ13C、δ15N）在揭示鱼类的生理动态、营养关系和产地溯源等方面具有独特的优势。样品的预处理方式可能在很大程度上影响鱼类组织同位素测定结果，但相关研究报道仍显不足，缺乏对于其内在机制的规律性认认识。本研究中，我们选取大黄鱼（Larimichthys crocea）—中国最重要的海洋养殖经济鱼类之一作为研究对象，评估了鱼体组织同位素分析前处理中两个关键步骤（肌肉去脂和鳞片酸浸）对大黄鱼组织碳氮稳定同位素组成的影响。结果表明，肌肉去脂操作总体上导致大黄鱼δ13C测值显著升高，而对鳞片进行酸浸操作则导致δ13C测值降低，同位素混合模型可以较好地解释预处理方式对鱼体组织δ13C测值的影响。这两种预处理方式均导致鱼体组织δ15N测值有所升高，暗示部分氮同位素信号的损失。根据鱼类生长过程中稳定同位素的动态平衡模型，建立了肌肉与鳞片碳氮同位素的理论替代关系，证实鳞片有望作为肌肉的替代物进行氮同位素分析。本研究为探讨大黄鱼稳定同位素组成的异质性提供了关键基础数据，对理解不同组织间的代谢动态具有参考价值，并为非致死性取样技术在鱼类稳定同位素研究中的应用提供了科学依据。Abstract: Stable carbon (δ13C) and nitrogen (δ15N) isotope compositions are powerful tools for elucidating fish physiology, trophic interactions, and origin. However, pretreatment methods can substantially influence isotopic results, and the underlying mechanisms remain poorly understood. This study investigates the effects of lipid removal from muscle and acid leaching of scales on the δ13C and δ15N values of large yellow croaker (Larimichthys crocea), a major mariculture species in China. We found that lipid extraction significantly increased muscle δ13C, while acid leaching decreased scale δ13C. An isotope mixing model effectively explained these δ13C variations. Conversely, both pretreatments increased δ15N, suggesting potential losses of specific nitrogen isotope signals. Utilizing a dynamic equilibrium model, we established a theoretical relationship between carbon and nitrogen isotopes in muscle and scales, validating scales as a muscle proxy for nitrogen isotope analysis. This research provides critical baseline data for understanding stable isotope heterogeneity in large yellow croaker, contributes to our understanding of inter-tissue metabolic dynamics, and supports the application of non-lethal sampling in fish stable isotope studies.
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1. 引言
鱼类是海洋食物网中一个重要环节，鱼类组织的碳氮稳定同位素（13C、15N）在揭示鱼类的生理动态[1]、营养关系[2]和产地溯源[3]等方面具有独特优势。稳定碳同位素组成能反映鱼类所处生态环境的碳源特征，可用于揭示鱼类的繁殖地、迁移路径等生活史信息[4]。稳定氮同位素在食物网中随着营养级升高发生15N富集，常被用于确定鱼类在食物网中的营养生态位，结合碳同位素可进一步推断鱼类的食性组成[5]。对鱼类碳氮稳定同位素的分析有助于理解海洋生态系统的复杂性，为渔业资源的可持续管理和保护提供科学依据。
在分析鱼类组织同位素组成时，预处理手段被广泛采用，并积累了较丰富的数据[6]。已有一些研究指出，预处理方式可能影响鱼类组织的碳氮同位素测值[7−8]，是解读碳氮同位素数据时不可忽视的因素。在鱼类组织同位素分析中，广泛采用背部白肌肉作为样本。然而，近年来也有少数研究表明，鳞片携带的同位素信号亦具有科学应用潜力[9−10]。Post等[11]指出，当肌肉组织中脂肪含量较高时，去脂操作可显著改变样品的碳氮同位素组成，受影响程度可能与样品的碳氮相对含量有关。类似地，由于鳞片中含有一定的无机碳（碳酸盐），经稀盐酸浸泡处理后，同位素组成也会发生变化[8]。值得一提的是，目前对样品预处理前后同位素组成的变化仍然缺乏规律性认识，尤其是对于同位素校正模型的选择尚缺乏机制层面的探讨，限制了碳氮同位素在鱼类生理生态学研究中的进一步应用。
大黄鱼（Larimichthys crocea）位列我国传统四大海产之首，素有“国鱼”之美誉。自上世纪90年代起，大黄鱼人工养殖关键技术得以突破并大范围推广，大黄鱼日益成为我国举足轻重的经济养殖鱼类。2023年，中国大黄鱼养殖产量高达28万吨，其中，福建省贡献了全国总产量近八成[12]，全产业链产值超200亿人民币。可见，大黄鱼对于福建省乃至全国的海洋经济而言，是一条当之无愧的“黄金鱼”。
目前已有若干研究将碳氮稳定同位素应用于大黄鱼研究，主要聚焦于其营养关系的确定与产地溯源[3, 5]。有关预处理方式对大黄鱼组织样品同位素测值影响的研究仍十分匮乏，相关机制性研究更是欠缺。鉴于此，本研究以养殖大黄鱼为对象，通过对照实验和同位素混合模型，探明样品处理方式对大黄鱼肌肉和鳞片碳氮同位素测定的影响。进而建立相关的定量校正关系，为非致死性取样方法应用于大黄鱼稳定同位素研究提供基础数据，也为深入理解大黄鱼的生态习性、种群结构及其与环境的相互作用提供科学支撑。提出的建模思路有望推广至其他鱼类，尤其是濒危鱼类，为制定科学的渔业管理政策、保护海洋生物多样性及促进海洋渔业可持续发展提供科学依据。
2. 材料和方法
2.1 样品采集
本研究中鲜活养殖大黄鱼样品产自福建宁德霞浦县，购于2024年3月。所有动物实验均遵循《实验动物护理和使用指南》[13]，并得到厦门大学海洋与地球学院实验动物实验委员会的批准。
2.2 样品处理
本研究随机选取9尾大黄鱼样品，测量了全长TL（头吻顶端至尾鳍末端）、体长L（头吻顶端至尾鳍基部）及体重M（湿重）三项生物学性状，长度测量结果精确至0.1 cm，质量测量结果精确至0.1 g。
用镊子在大黄鱼侧线以上区域采集鳞片，收集至无菌离心管，以纯水吹打洗净。取5片鳞片加入装有2 mL 1.2 mol/L稀盐酸的离心管中，室温下浸泡24 h，期间摇匀1次。倒出盐酸后用纯水洗至中性，另取5片鳞片作为对照组。采集完鳞片后，用预先灼烧过的解剖刀在鱼体背鳍下方、脊椎上方切口，取背部白肌肉，纯水洗净并以无尘纸擦干后置于无菌表面皿中。将所有组织样品于60℃下烘干48 h。鳞片样品以鳞焦为中心，用无菌剪刀将鳞片分成扇形小块。肌肉样品烘干后研磨均质化，取约1 cm3均质样品置于无菌玻璃瓶中，加入5 mL氯仿−甲醇（2∶1，v∶v）混合溶液，室温下密封静置12 h。滤除溶剂后用混合溶液冲洗3遍，将滤膜放置在通风橱中，待溶剂自然挥发近干，再于60℃下烘干48 h，从滤膜上分离出样品。将样品（肌肉～0.15 mg；鳞片～0.20 mg）包入锡舟（SA76981103, Säntis），进样量用校准后的百万分之一天平（ME36S, Sartorius）称量确定。所有样品均制备一份平行样。
2.3 碳氮含量及其同位素比值测定
碳氮含量及其同位素比值采用元素分析仪-稳定同位素比值质谱仪（EA-IRMS）分析（Flash EA
1112 NC Analyzers, Delta V Advantage Isotope Ratio MS, Thermo Scientific）。元素分析系统氧化柱填料为氧化铬、镀银氧化钴和银丝，温度980℃；还原柱填料为高纯铜，温度650℃；载气He流量为100 mL/min。在元素分析仪中，样品的碳、氮元素被分别转化成CO2与N2，继而进入色谱柱（SA990722, Säntis），色谱柱温50℃。氮同位素标准品采用IAEA-N-2（δ15NAir = 20.4‰）和IAEA-NO-3（δ15NAir = 4.7‰）；碳同位素标准品采用IAEA-C8（δ13CVPDB = −18.3‰）和USGS40（δ13CVPDB = −26.4‰）；质量标准采用烟酰胺（C6H6N2O）。每8～10个样品后插入1组标准物质，以其测量值与标准值做工作曲线用于校正。样品碳氮稳定同位素δ值由式(2.1)计算。
$$ \delta \left({‰}\right)=\left({R}_{sp}/{R}_{std}-1\right)\times 1000 $$ (1) 其中，Rsp为样品的13C/12C或15N/14N，Rstd为同位素标准品的13C/12C（RVPDB =
0.0011120 ）或15N/14N（RAir =0.0036765 ），δ值的测量精度优于0.2‰。2.4 数据处理与模型评价
2.4.1 对预处理后δ13C值变化的校正
对于肌肉的δ13C值，本研究综合脂质校正模型的相关研究成果，以Δ表示去脂后样品δ13C值的变化量；将去脂前的δ13C值和碳氮（原子）比C∶N作为备择自变量，选择了3种线性模型和3种非线性模型进行对比。
线性模型是对C∶N比值低于10的样品去脂后δ13C值变化规律的局部近似[11]。其中模型1和模型2的零点分别等价于样品经完全去脂后的δ13C值和C∶N比值（记作x0 = −b/a），而单论每个参数并无实际含义。
$$ \Delta =a+b\cdot{{\delta }}^{13}C $$ (2) $$ \Delta =a+b\cdot C:N $$ (3) 在一元线性回归的基础上，可以进一步构建二元线性回归模型：
$$ \Delta =a+b\cdot{\delta}^{13}C+c\cdot C:N $$ (4) 非线性模型中，反比例型函数源自同位素混合模型的推导结果[14]。模型4和模型5的参数a均代表去脂时残留部分和溶解部分两个端元δ值的差异，零点x0 = −b/a为样品经完全去脂后的C : N比值。
$$ \Delta =a+b\cdot{\left(\mathrm{C}:\mathrm{N}\right)}^{-1} $$ (5) $$ \Delta =a+b\cdot{\left(\mathrm{C}:\mathrm{N}+c\right)}^{-1} $$ (6) 对数型函数则是对C∶N比值介于2～25的样品去脂后δ13C值变化规律的局部近似[15]。零点x0 = e−b/a为样品经完全去脂后的C∶N比值。
$$ \Delta =a+b\cdot\ln(C:N) $$ (7) 对于鳞片的δ13C值，本研究通过衍生同位素混合模型获得函数关系（推导详见附件）。假设鳞片由同位素端元值恒定的有机碳（δO）和无机碳（δI）混合而成，酸浸后鳞片中无机碳的残留率是定值α（0≤α＜1）；酸浸前后鳞片的δ13C值分别记作δT和δA。则有：
$$ {\delta }_{A}=\frac{\left({\delta }_{O}-\alpha {\delta }_{I}\right){\delta }_{T}+\left(\alpha -1\right){\delta }_{O}{\delta }_{I}}{\left(1-\alpha \right){\delta }_{T}+\alpha {\delta }_{O}-{\delta }_{I}} $$ (8) 使用Matlab R2024b求解模型参数。以均方根误差（Root mean square error, RMSE）为约束，通过Matlab内置的fmincon( )函数求解未知参数。
2.4.2 同位素校正模型的评价
采用R2评价数据的模型拟合效果：
$$ {\mathrm{R}}^{2}=1-\mathrm{S}\mathrm{S}\mathrm{E}/\mathrm{S}\mathrm{S}\mathrm{T} $$ (9) 其中，SSE为残差平方和，即模型拟合数据
$ {\widehat{y}}_{i} $ 和原始数据$ {y}_{i} $ 的误差的平方和；SST为离差平方和，即原始数据$ {y}_{i} $ 和均值$ \overline{y} $ 之差的平方和。采用赤池信息准则（Akaike information criterion，AIC）评价模型优劣[16]。在样本量不大的情况下，对AIC进行修正得到AICc（式2.5），模型AICc值越小，表示其在考虑到复杂度限制情况下拟合效果越好[17]。
$$ \mathrm{AIC}=-2\ln\left(L\right)+2k $$ (10) $$ \mathrm{AICc}=\mathrm{AIC}+\frac{2k\cdot\left(k+1\right)}{n-k-1} $$ (11) 其中，k为模型参数个数；
$ \mathrm{ln}\left(L\right) $ 为模型的最大对数似然值；n为样本量。假设模型的误差服从独立正态分布，则
$ \mathrm{ln}\left(L\right) $ 按式(2.6)计算：$$ \mathrm{ln}\left(L\right)=-\frac{n}{2}\cdot\ln\left(2\text{π} \right)-\frac{n}{2}\cdot\ln\left(\mathrm{SSE}/n\right)-\frac{n}{2} $$ (12) 2.4.3 不同组织δ值的替代关系构建
假设鱼类质量按指数增长，在t = 0时刻由于某种原因（如更换饵料）导致食物源同位素组成发生改变，有机体将需要重建同位素平衡状态。根据同位素质量平衡可获得如下指数规律[18]：
$$ {\delta }_{t}={\delta }_{b}+\left({\delta }_{a}-{\delta }_{b}\right)\cdot{e}^{-\lambda t} $$ (13) 其中，δt为重建同位素平衡过程中任意时刻t对应的同位素值；δa和δb分别为重建平衡前后的同位素值；λ为稳定同位素周转常数，系生长系数k和新陈代谢周转常数m之和。
鳞片组织的同位素变化也应符合上述指数衰变规律，为便于区分，在δ和λ上加“′”表示，即：
$$ {\delta }_{t}{'}={\delta }_{b}{'}+\left({\delta }_{a}{'}-{\delta }_{b}{'}\right)\cdot{e}^{-\lambda't} $$ (14) 联立式(2.7)和式(2.8)，消去t得：
$$ {\delta }_{t}{'}={\delta }_{b}{'}+\left({\delta }_{a}{'}-{\delta }_{b}{'}\right)\cdot{\left(\frac{{\delta }_{t}-{\delta }_{b}}{{\delta }_{a}-{\delta }_{b}}\right)}^{\lambda '/\lambda } $$ (15) 由于同一生物组织样品碳氮同位素δ值的变化范围几乎不超过10‰，因此即使理论表达式呈非线性，数据在小范围内的变化也可被直线拟合。使用Matlab内置的polyfit( )、polyval( )和polyconf( )函数分别进行线性拟合、预测和95%置信区间估计，并使用Person相关系数r和显著性p值评价。
3. 结果
3.1 生物学性状
本研究大黄鱼样品全长TL介于27.5～33.2 cm，体长L介于24.7～29.3 cm，体重W介于245.8～428.1 g，经单样本Kolmogorov-Smirnov检验均服从均匀分布（渐进显著性 > 0.05），可以作为市售养殖大黄鱼样品的代表。样品全长与体长呈线性关系（p < 0.001），全长/体长比介于1.10～1.13，体重与体长之间服从幂型函数关系（W = 0.021 · L2.93），呈匀速生长特性，与现行大黄鱼国家标准（GB/T
32755 —2016）的特征相吻合[19]。根据林美金等[20]提出的闽−粤东族网箱养殖大黄鱼体重与年龄的关系，估计本批样品处于19～26月龄。3.2 碳、氮同位素组成
大黄鱼肌肉去脂前δ13C值介于−22.5‰～−19.8‰，δ15N值介于11.7‰～12.9‰；去脂后δ13C值介于−17.0‰～−16.3‰，δ15N值介于13.6‰～14.5‰（表1）。对比去脂前后，δ13C值与δ15N值均发生显著变化（p < 0.001，t检验），其中δ13C与δ15N值分别平均升高4.4‰及1.5‰（图1a & c）。大黄鱼鳞片酸浸前δ13C值介于−14.5‰～−12.3‰，δ15N值介于10.8‰～12.2‰；酸浸后δ13C值介于−14.7‰～−13.2‰，δ15N介于11.4‰～12.7‰（表1）。对比酸浸前后，δ13C值与δ15N值均发生显著变化（p < 0.05，t检验），其中δ13C值平均降低0.6‰，δ15N值平均升高0.3‰（图1b & d）。此外，不同组织的δ13C值和δ15N值均存在显著差异（p < 0.005，t检验）。肌肉δ13C值与体长负相关，酸浸鳞片δ13C值与体长正相关，但线性关系均不显著（p > 0.1，图1e & f）。
表 1 样品碳氮同位素δ值及C∶N比值统计数据Table 1. Statistical data of δ values of carbon and nitrogen isotopes and C∶N ratio of samples样品类别 δ13C / ‰ δ15N / ‰ C∶N 平均值 标准差 最小值 最大值 平均值 标准差 最小值 最大值 平均值 标准差 最小值 最大值 肌肉 −21.1 1.1 −22.5 −19.8 12.5 0.3 11.7 12.9 6.80 1.37 5.09 8.96 去脂肌肉 −16.7 0.2 −17.0 −16.3 14.0 0.2 13.6 14.5 3.74 0.17 3.32 3.90 鳞片 −13.6 0.7 −14.5 −12.3 11.6 0.5 10.8 12.2 3.53 0.08 3.40 3.66 酸浸鳞片 −14.2 0.5 −14.7 −13.2 11.9 0.5 11.4 12.7 3.37 0.02 3.35 3.42 
图 1 大黄鱼样品预处理前后δ13C值和δ15N值的变化（a～d）及各组织有机碳δ13C与体长L的关系（e～f）（虚线为拟合直线；阴影为95%置信区间）Figure 1. Changes in δ13C and δ15N values before and after pretreatment of large yellow croaker samples (a～d) and the relationship between organic carbon δ13C and body length L in various tissues (e～f) (dashed line represents fitted line; shaded area represents 95% confidence interval)3.3 碳、氮含量及C∶N比
大黄鱼样品肌肉去脂前碳含量介于53.9%～72.8%，氮含量介于8.8%～15.0%，去脂后碳含量介于36.8%～43.9%，氮含量介于12.9%～13.6%；鳞片酸浸前碳含量介于24.8%～32.4%，氮含量介于7.9%～11.1%，酸浸后碳含量介于38.2%～48.8%，氮含量介于13.3%～17.0%。经t检验，各组织处理前后碳氮含量均发生显著变化（p < 0.001，图2a & b）。大黄鱼样品肌肉碳氮比C∶N比值去脂前介于5.09～8.96，去脂后介于3.32～3.90；鳞片酸浸前C∶N比值介于3.40～3.66，酸浸后介于3.35～3.42（表1）。经t检验，肌肉和鳞片经处理后C∶N比值均显著降低（p < 0.001），平均降幅分别为3.06和0.16（图2c）。
图 2 大黄鱼不同组织的（a）碳含量、（b）氮含量及（c）碳氮比Figure 2. (a) Carbon content, (b) nitrogen content, and (c) carbon to nitrogen ratio in different tissues of yellow croaker3.4 预处理后δ13C值变化的模拟
3.4.1 肌肉去脂模型
在无边界条件约束的情况下，6个脂质校正模型均能较好地拟合数据（R2 ≥ 0.9，表2），其中模型3的R2最高，模型1次之。由于模型3复杂度较高，AICc受惩罚因子影响而显著增大，故AICc最低的模型1略优。
表 2 脂质校正模型拟合结果Table 2. Fitting results of lipid correction model编号 模型 无边界条件约束 有边界条件约束 a b c R2 AICc a b c R2 AICc 1 Δ = a + b · δ13C −14.22 −0.88 / 0.96 28.10 ND ND ND ND ND 2 Δ = a + b · C∶N −0.11 0.66 / 0.91 28.86 −4.27 1.23 / 0.12 31.18 3 Δ = a + b · δ13C + c · C∶N −9.39 −0.57 0.27 0.99 31.71 ND ND ND ND ND 4 Δ = a + b · (C∶N)−1 8.87 −29.34 / 0.90 29.02 9.83 −36.28 / 0.84 29.50 5 Δ = a + b · (C∶N + c) −1 26.54 −735.34 26.45 0.92 33.64 10.49 −43.86 0.49 0.81 34.44 6 Δ = a + b · ln(C∶N) −4.10 4.48 / 0.91 28.88 −8.96 6.94 / 0.60 30.41 注：/ 表示不存在该参数；ND表示无数据。Note: / indicates that the parameter does not exist; ND indicates no data. 模型1的零点x0 = −16.2‰，代表去脂后样品的δ13C值，与实测平均值（−16.7‰）相近。以C∶N比作为单一自变量的模型包含模型2（x0 = 0.17）、模型4（x0 = 3.31）、模型5（x0 = 2.50）和模型6（x0 = 1.26），其零点均代表去脂后样品的碳氮比，但不同模型的结果差异巨大，且均低于实测平均值（3.74）。将去脂后样品的碳氮比数据视为Δ = 0的观测值纳入数据集，以此模拟边界条件，重新评价模型结果（图3）。在边界条件的约束下，模型R2均下降，线性模型和对数模型的过拟合被解除，此时R2最高AICc最低的模型4占优（表2）。
图 3 增加约束条件后各校正模型的拟合效果Figure 3. The fitting effect of each calibration model after adding constraints3.4.2 鳞片酸浸模型
择取不同端元值对数据进行拟合，模型R2与同位素端元值的关系如图4所示。局部最优解为δO = −14.5‰，δI = −12.1 ‰，α = 0.13。必须指出，该解集并不能直接用于碳形态的计算，一是因为有机碳端元值δO高于鳞片样本δ13C值的最小值（−14.7%），不符合实际情况；而严格限制边界条件后，δO - R2图像不存在极大值点，此时人为定义的边界值总是成为最优解，有违模型拟合初衷。二是无机碳端元值δI偏负，与一般碳酸盐矿物的碳同位素δ值范围相差较大，说明模型假设或原始数据集仍存在瑕疵，从而可能导致了模型的过度拟合。
图 4 同位素混合模型在不同端元值下对鳞片酸浸前后δ13C数据的拟合效果Figure 4. The fitting effect of isotope mixing model on δ13C data of scales before and after acid leaching at different endmember values若取δI = 0‰，则拟合出δO = −14.7‰，α = 0.44，拟合效果（R2 = 0.50）略优于线性回归模型，且模型中各参数均具有实际含义。根据同位素混合模型，可另计算得样品有机碳份额介于83.9%～98.8%，平均值92.9%，标准差5.0%。结果表明，样品中绝大部分碳以有机形态存在，酸浸对碳同位素测量结果的影响有限；此外，无机碳残留率α > 0，说明酸浸操作（使用1.2 mol/L盐酸浸泡完整鳞片24 h）未能完全去除鳞片中的无机碳。
3.5 鳞片对肌肉组织同位素δ值的替代潜力
对大黄鱼肌肉和鳞片碳氮同位素δ值的线性回归分析（图5）显示：对于δ13C值，肌肉与鳞片无显著线性关系。对肌肉和鳞片组织分别进行去脂和酸浸处理后，线性模型的相关性和显著性均有所提升，但R2最高仅0.12，无法达到相互替换进行数值分析所需的精度。对于δ15N值，肌肉与鳞片同样无法直接建立线性关系，但去脂肌肉和酸浸鳞片的线性关系已经具备较高的显著性（p < 0.05），R2提高至0.51，通过增大样本量有望进一步提高模型参数的准确性。
图 5 大黄鱼不同组织间δ13C值和δ15N值的关系（虚线为拟合直线；阴影为95%置信区间）Figure 5. Relationship between δ13C and δ15N among different tissues of yellow croaker (dashed line represents fitted line; shaded area represents 95% confidence interval)4. 讨论
4.1 大黄鱼组织同位素组成的异质性
4.1.1 氮同位素组成
氮元素在肌肉和鳞片中均主要以氨基酸及其相关化合物（如蛋白质、氨基酸衍生物等）存在。不同氨基酸在体内的生理功能和生化反应动力学差异造就了氨基酸单体的δ15N值差异，故不同组织的氨基酸组成差异主控了整体氮同位素的异质性。根据对大黄鱼肌肉和鳞片氨基酸组成的调查结果[21–26]，大黄鱼肌肉中各必需氨基酸相对总氨基酸的占比均高于鳞片，但并非所有非必需氨基酸占比都低于鳞片，例如，肌肉中的谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸占比分别是鳞片中的1.4、1.5和1.2倍。在鳞片的氨基酸组成中，甘氨酸占据主要地位，其占比为肌肉中的4.6倍，这是由胶原蛋白的结构决定的[27]，其次是丙氨酸和脯氨酸，占比分别为肌肉中的1.5倍和1.8倍（图6）。
图 6 大黄鱼肌肉和鳞片的氨基酸组成差异（鳞片氨基酸数据来自罗红宇[21]；肌肉氨基酸数据来自颜孙安等[22]、李松等[23]、郭全友等[24]、吴燕燕等[25]、徐大凤等[26]的平均值；图中未列出占比<1%的氨基酸，包括色氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺）Figure 6. Differences in amino acid composition between muscles and scales of yellow croaker (scale amino acid data from Luo Hongyu[21]; muscle amino acid data from the average values of Yan S et al.[22], Li S et al.[23], Guo Q et al.[24], Wu Y et al.[25], Xu D et al.[26]; amino acids with a proportion of less than 1% are not listed in the figure, including tryptophan, cysteine, glutamine and asparagine)氮是重要的营养元素，相比于鳞片组织，必需氨基酸会优先分配和储存至需要支持更复杂生理功能的肌肉组织中。根据同位素动力学特性，重同位素在肌肉组织代谢过程中会在底物中富集，使肌肉δ15N值升高。在可以内源合成的非必需氨基酸中，谷氨酸最为特殊，其对于鱼类体内的氨代谢具有非常重要的作用[28]。由于频繁发生氮的交换，导致在高营养级的鱼类体内，谷氨酸单体δ15N值甚至可以被富集到30‰左右[29−30]。在氮交换过程中，较轻的氮同位素（14N）一部分变成氨气、尿素等代谢废物被排出体外，另一部分则作为其他非必需氨基酸合成时的氮源[29]。这使得由谷氨酸直接或间接合成的氨基酸单体δ15N值一般低于谷氨酸本身。例如，对于营养级介于1～4的生物，其脯氨酸单体δ15N值比谷氨酸平均低～3.7‰[30−31]。同理，甘氨酸可由丝氨酸转化，后者在肌肉中占比较高。丙氨酸可由丙酮酸与游离氨化合而成，这些低δ15N值的游离氨主要来自谷氨酸和天冬氨酸的降解产物[29]。故整体而言，鳞片的δ15N值略低于肌肉。
4.1.2 碳同位素组成
大黄鱼肌肉主要由水分（～69.9%）、蛋白质（～16.4%）和脂肪（～11.8%）等组成[22–24, 26]；鳞片由胶原蛋白为主的角质和羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]为主的骨质两部分组成，几乎不含脂肪[21]。两类组织中，糖类含量均极低（～0.2%），对δ13C的影响可忽略，而相比于蛋白质，脂肪的δ13C值较低[32]，因此，鳞片的δ13C值比肌肉高，待肌肉去脂后，该差异缩小至～3‰。鳞片中的羟基磷灰石在形成过程中，磷酸根离子可以被碳酸根离子部分替代，形成碳磷灰石[Ca5(PO4,CO3)3(OH)] [33]。而无机碳的δ13C值通常显著高于有机碳[34]，故酸浸去除无机碳后，鳞片的δ13C值下降0.6‰，进一步缩小了与去脂肌肉之间的差距。剩余差异一部分源自预处理时未除尽物质的干扰，另一部分主要源自不同组织的氨基酸组成差异。Chua等[35]和McMahon等[29]分别测定了5种淡水鱼和5种海水鱼的氨基酸单体碳同位素组成，结果均表明必需氨基酸δ13C值的平均值低于非必需氨基酸，且在非必需氨基酸中，又以谷氨酸和天冬氨酸δ13C值较低。上述氨基酸在大黄鱼肌肉中的占比均高于鳞片（图6），因此氨基酸组成差异可能是解释去脂肌肉和酸浸鳞片总体δ13C值差异的重要一环。
有趣的是，肌肉δ13C值随体长增大而减小（图1e），说明大黄鱼在生长阶段内肌肉组织中的12C占比升高，这可能与低δ13C饲料的摄入有关[36]。与之相反，鳞片δ13C值随体长的增大而增大，呈现出对13C更强的富集（图1f）。这可能暗示了碳同位素在不同组织间的代谢存在动力学差异。但需指出的是，由于大黄鱼肌肉和鳞片δ13C值随体长L的变化显著性低（p > 0.1），因此不应高估体长变化在大黄鱼组织碳同位素分馏中的作用。
4.2 肌肉去脂对同位素组成的影响
4.2.1 对碳同位素的影响与校正
我们推测，脂质减少是大黄鱼肌肉去脂后δ13C增加的主要原因。脂质碳δ13C值低，但占总有机碳的比例高（～40%）。在制样过程中，脂肪的部分损失会给结果带来较大不确定度。为降低测量成本，可构建校正模型，以计算去脂对样品δ13C值的影响。在模型选择方面，贡艺等[37]和徐亮等[38]分别对北太平洋柔鱼和南海鸢乌贼肌肉碳同位素进行校正时指出，模型自变量选用δ13C值（即模型1）的效果要比C∶N比好。但由于Δ是由δ13C构造的变量，且去脂后样品δ13C值相近，这必然会影响线性拟合的评价结果。若模型1的线性成立，则去脂前后的δ13C值亦应存在线性关系，然而实际相反（R2 = 0.30，p = 0.13），恰说明以去脂前样品δ13C值为自变量的模型误差较大，无法满足预测需求，故不宜用于脂质校正。
以C∶N比为自变量的校正模型中，线性模型适用于C∶N比值介于2～10的样品，而非线性模型适用的范围更宽（C∶N比值介于2～63）[7]。本研究样品符合线性模型的使用条件，线性关系也较好，但模型零点x0偏离实际，是模型过拟合的表现。因此，对C∶N比值在5～9之外的样品，模型2和模型6预测的Δ将偏高（图3）。加入边界条件后，模型2和模型6因性能太差被淘汰，模型4和模型5仍保持较好的拟合效果。当C∶N比值低于12.8时，两模型结果的差异低于测量误差，其中模型4以更低的复杂度占据优势。
选择模型时，过拟合的问题仅凭R2和AICc无法甄别，故常被过往研究忽略。杨蕊等[39]构建前肛鳗肌肉δ13C值校正模型时，通过分段函数进一步提高拟合效果。此举在应用层面是积极的，但同时增加了过拟合的风险。反之，通过控制零点范围，设置更严格的边界条件或能改善此情况，更适合进行机制性的研究和讨论，可推广至其他鱼类肌肉去脂的δ13C值校正模型研究。
4.2.2 对氮同位素的影响
McMahon等[29]指出，去脂过程中氨基酸单体的碳、氮同位素并不发生显著分馏，但与脂质结合的氨基酸（如谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸等）相对含量将下降，该效应对总体氮同位素δ值产生负的影响。与此同时，由于去脂剂在去脂过程中不仅去除脂肪、固醇等不含氮的脂类化合物，还会将含氮的部分糖脂、磷酯等脂类化合物一并溶解去除[40]，后者δ15N值低于蛋白质的δ15N值，故去脂之后总体δ15N值升高。De Lecea等[41]指出，烘干温度超过80℃时，样本内亦会发生氮同位素分馏，并损失低δ15N的信号。本研究烘干温度较低，该影响是次要的。
与受蛋白质和脂质主控的δ13C不同，δ15N受到的影响更复杂。相关组分含量低，且不确定性较大，作为端元不够稳定，很难通过混合模型追溯。Bodin等[40]在甲壳动物组织中的研究中，借鉴碳同位素的校正方法，将δ15N值的变化量与C∶N比进行建模，虽检测到线性显著性，但模型相关性极弱，可解释性差。本研究使用的4种模型亦均无显著性（p > 0.1），与大部分研究一致。考虑到有机氮的损失必然伴随碳的损失，此时碳氮比或不再是一个好的自变量。总之，在解析氮同位素信号损失方面，目前尚无较大的理论突破。在需要使用整体δ15N值的实际工作中，应在去脂前进行测量。
4.3 鳞片酸浸对同位素组成的影响
鳞片酸浸后δ13C值的变化由无机碳主导，而影响其变化量的因素包括碳酸盐含量、无机碳δ13C值等。Ventura等[8]指出，鳞片碳酸盐含量低于7%（或总矿物质含量低于20%）时，酸浸对鳞片δ13C值无显著影响。O'Toole C等[42]对9组不同来源的大西洋鲑（Salmo salar）进行鳞片酸浸实验，结果中大部分δ13C值无显著变化，仅一组显著降低。本研究中，大黄鱼鳞片无机碳占比高于该阈值，酸浸后δ13C值显著降低。Oehlert等[34]指出，海洋硬骨鱼生产的碳酸钙中，由有机碳转化的部分δ13C值略低。是以鳞片无机碳的δ13C值特征受饮食中的有机碳和水体溶解无机碳共同影响，但必然高于体内的有机碳。因此，无机碳的去除对鳞片整体δ13C值呈负效应，对该过程的定量预测还需通过更广泛的鱼类样本数据对模型进行验证和调整。
酸浸主要去除无机碳[43]，但对于结构分层且具有一定厚度和韧性的鳞片样品，该方法仍存在不确定性。目前对酸浸前后氮同位素变化的认识尚弱。酸浸使大黄鱼鳞片δ15N值小幅升高，推测是游离含氮有机物溶解及蛋白质水解共同导致。Ventura等[8]提出，鳞片中的氮可能以有机形态与矿物质结合，在酸浸处理时，矿物溶解并释放有机氮，进而改变δ15N值。Syväranta等[44]对鲱形白鲑（Coregonus clupeaformis）鳞片进行酸浸后观察到相同规律，但囿于鳞片中游离含氮化合物的研究匮乏，该假说尚未得到实证。本研究对酸浸条件的探索尚存局限，酸浸时间过长可能导致δ15N值低的氨基酸脱离鳞片而对同位素测定结果产生影响，将鳞片粉碎处理并缩短样品酸浸时间，或可降低无机碳的残留率和有机组分的损失，取得更具代表性的结果。总而言之，鳞片酸浸过程中δ15N变化的机制尚不明确。未来需就各潜在调控因素进行探索。
4.4 不同组织同位素组成的相关关系
Hanisch和Robert首次将非致死性取样手段引入鱼类稳定碳氮同位素研究[45]，此后，肌肉的替代组织由鳍[9]、鳞片[43]逐渐扩展至体表粘液等[46]。然而，相关研究涉及的鱼类物种仍然非常有限，而且替代组织同位素δ值的准确校正关系因物种而存在差异[47]。Chiang等[48]回顾既往研究后指出，碳同位素δ值的替代关系通常较氮而言更差。本研究发现，大黄鱼鳞片在氮同位素分析上具有替代肌肉的潜力，碳同位素则不然。这一特征与欧白鱼（Alburnus alburnus）[47]、鳙鱼（Hypophthalmichthys molitrix）[10]一致，但并不适合外推至其他鱼种。
非致死性样本替代肌肉进行同位素分析时，预处理方法可能影响替代关系的准确性。大黄鱼肌肉和鳞片样品分别经去脂与酸浸处理后，碳、氮同位素替代关系的显著性均提高。Syväranta等[44]也指出，鳞片酸浸后，δ13C值与肌肉的相关性增强。说明用于分析碳、氮同位素的样品在物质组成上越简单，受个体差异的影响越小，展现的规律与特征也就越稳定。因而在测定大黄鱼碳同位素组成时，进行肌肉去脂和鳞片酸浸或相应的数值校正是非常有必要的。
此外，鳞片组织会随鱼类生长而向外扩展，不同位置的同位素特征可能反映其生活史不同阶段的变化[49]。反之，鳞片取样区域的选择会影响同位素测定结果，进而可能影响替代关系的构建。因此需指出，大黄鱼鳞片的δ15N值虽能与去脂肌肉的δ15N值建立显著的线性关系，但后者的性质与肌肉整体δ15N值存在差异。在利用δ15N值进行营养级计算、食性分析、产地溯源等工作时，能否使用鳞片氮同位素值完全替代仍有待商榷。
4.5 展望
本研究在样本代表性、预处理方案设计和模型应用方面尚有不足。首先，样本量可能不足以全面反映大黄鱼不同个体的同位素异质性，影响统计分析结果的准确性。其次，样品干燥、鳞片酸浸等过程中未排除副反应（如含氮有机物的分解）可能发生的同位素分馏，或增大测量结果的不确定度。此外，本研究尚无法充分验证模型中端元值恒定的假设，对不同物种、不同自然环境条件下的普适性还有待进一步检验。未来研究应针对上述局限，从多方面入手，继续扩大样本量，优化各组织的预处理条件，改良模型的假设体系并予以验证，明确模型规律的外推边界，进一步提高研究结果的可靠性和适用性。
5. 结论
大黄鱼肌肉与鳞片组织在碳氮稳定同位素组成上差异显著，这些差异可能与组织间不同的生化组成和代谢途径有关。肌肉去脂和鳞片酸浸会对大黄鱼碳氮同位素分析结果产生显著影响。基于同位素混合模型建立的针对肌肉去脂和鳞片酸浸的碳同位素校正模型结果表明，肌肉去脂后δ13C值升高，其变化可用样品碳氮比进行校正；鳞片酸浸后δ13C值降低，但碳仍主要以有机形态存在，且常规的酸浸处理不能完全去除无机碳。肌肉和鳞片δ13C值间无显著相关性，无论是否经去脂或酸浸处理，但分别经去脂和酸浸处理后的δ15N值显示出较好的线性相关性和显著性，表明鳞片有潜力作为肌肉的替代组织进行氮同位素分析。
致谢：感谢邱雨生高级工程师、田娟、武佳星、姜洲、张佳莹、姚思琦、林泽恒等在样品预处理、仪器调试和样品测试方面提供的帮助；感谢厦门大学海洋与地球学院实验教学中心提供的仪器支持。本项目获福建省科技计划项目（2023Y0001）；中央高校基本科研业务费专项（20720232022）；厦门大学大学生创新训练计划项目（202310384090）资助。
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图 1 大黄鱼样品预处理前后δ13C值和δ15N值的变化（a～d）及各组织有机碳δ13C与体长L的关系（e～f）（虚线为拟合直线；阴影为95%置信区间）
Fig. 1 Changes in δ13C and δ15N values before and after pretreatment of large yellow croaker samples (a～d) and the relationship between organic carbon δ13C and body length L in various tissues (e～f) (dashed line represents fitted line; shaded area represents 95% confidence interval)
图 2 大黄鱼不同组织的（a）碳含量、（b）氮含量及（c）碳氮比
Fig. 2 (a) Carbon content, (b) nitrogen content, and (c) carbon to nitrogen ratio in different tissues of yellow croaker
图 3 增加约束条件后各校正模型的拟合效果
Fig. 3 The fitting effect of each calibration model after adding constraints
图 4 同位素混合模型在不同端元值下对鳞片酸浸前后δ13C数据的拟合效果
Fig. 4 The fitting effect of isotope mixing model on δ13C data of scales before and after acid leaching at different endmember values
图 5 大黄鱼不同组织间δ13C值和δ15N值的关系（虚线为拟合直线；阴影为95%置信区间）
Fig. 5 Relationship between δ13C and δ15N among different tissues of yellow croaker (dashed line represents fitted line; shaded area represents 95% confidence interval)
图 6 大黄鱼肌肉和鳞片的氨基酸组成差异（鳞片氨基酸数据来自罗红宇[21]；肌肉氨基酸数据来自颜孙安等[22]、李松等[23]、郭全友等[24]、吴燕燕等[25]、徐大凤等[26]的平均值；图中未列出占比<1%的氨基酸，包括色氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺）
Fig. 6 Differences in amino acid composition between muscles and scales of yellow croaker (scale amino acid data from Luo Hongyu[21]; muscle amino acid data from the average values of Yan S et al.[22], Li S et al.[23], Guo Q et al.[24], Wu Y et al.[25], Xu D et al.[26]; amino acids with a proportion of less than 1% are not listed in the figure, including tryptophan, cysteine, glutamine and asparagine)
表 1 样品碳氮同位素δ值及C∶N比值统计数据
Tab. 1 Statistical data of δ values of carbon and nitrogen isotopes and C∶N ratio of samples
样品类别 δ13C / ‰ δ15N / ‰ C∶N 平均值 标准差 最小值 最大值 平均值 标准差 最小值 最大值 平均值 标准差 最小值 最大值 肌肉 −21.1 1.1 −22.5 −19.8 12.5 0.3 11.7 12.9 6.80 1.37 5.09 8.96 去脂肌肉 −16.7 0.2 −17.0 −16.3 14.0 0.2 13.6 14.5 3.74 0.17 3.32 3.90 鳞片 −13.6 0.7 −14.5 −12.3 11.6 0.5 10.8 12.2 3.53 0.08 3.40 3.66 酸浸鳞片 −14.2 0.5 −14.7 −13.2 11.9 0.5 11.4 12.7 3.37 0.02 3.35 3.42 
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表 2 脂质校正模型拟合结果
Tab. 2 Fitting results of lipid correction model
编号 模型 无边界条件约束 有边界条件约束 a b c R2 AICc a b c R2 AICc 1 Δ = a + b · δ13C −14.22 −0.88 / 0.96 28.10 ND ND ND ND ND 2 Δ = a + b · C∶N −0.11 0.66 / 0.91 28.86 −4.27 1.23 / 0.12 31.18 3 Δ = a + b · δ13C + c · C∶N −9.39 −0.57 0.27 0.99 31.71 ND ND ND ND ND 4 Δ = a + b · (C∶N)−1 8.87 −29.34 / 0.90 29.02 9.83 −36.28 / 0.84 29.50 5 Δ = a + b · (C∶N + c) −1 26.54 −735.34 26.45 0.92 33.64 10.49 −43.86 0.49 0.81 34.44 6 Δ = a + b · ln(C∶N) −4.10 4.48 / 0.91 28.88 −8.96 6.94 / 0.60 30.41 注：/ 表示不存在该参数；ND表示无数据。Note: / indicates that the parameter does not exist; ND indicates no data.
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