The association of single nucleotide polymorphisms of the glycogen phosphorylase gene with glycogen content in the razor clam Sinonovacula constricta
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摘要: 为探究缢蛏糖原磷酸化酶基因（Sc-GPH）与糖原含量的关系，本研究克隆获得Sc-GPH cDNA全长，检测其在不同组织、不同月份的表达模式，并在Sc-GPH基因编码区筛选与糖原含量关联的SNP位点。结果表明，Sc-GPH cDNA全长为3 963 bp，开放阅读框为2 541 bp，编码846个氨基酸；氨基酸序列多重比对和系统发育树显示，缢蛏与欧洲大扇贝、虾夷扇贝、长牡蛎等贝类亲缘关系较近，而与哺乳类、甲壳类、昆虫类亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果显示，Sc-GPH在8个组织中均有表达，其中在外套膜和足中表达量最高（p<0.01），推测与其糖原存储能力有关；不同月份的缢蛏外套膜和足中，Sc-GPH在8月表达量最高，而此时糖原含量较低，说明Sc-GPH的表达可能受缢蛏生殖周期的影响。以缢蛏“甬乐1号”群体为实验材料，在Sc-GPH基因编码区筛选到4个与糖原含量相关SNP位点，其中c.930T>C位点在台州野生群体中得到进一步验证，该位点为高糖原缢蛏分子标记辅助选育提供了候选标记。Abstract: To clarify the relationship between the glycogen phosphorylase gene (Sc-GPH) and glycogen content in Sinonovacula constricta, the full-length cDNA sequence of Sc-GPH is obtained using RACE technology, its expression pattern in different tissues, different months are analyzed, and the SNP loci of Sc-GPH associated with glycogen content are explored. The full-length cDNA of Sc-GPH gene is 3 963 bp and the ORF is 2 541 bp, encoding 846 amino acids. The multiple alignment of amino acid sequences and phylogenetic tree show that S. constricta are closely related to shellfish such as Pecten maximus, Mizuhopecten yessoens, Crassostrea gigas, but farther to mammals, arthropodas and insects. The results of real-time quantitative PCR show that Sc-GPH gene is expressed in eight tissues, with the highest expression in mantle and foot, suggesting they are related to glycogen storage capacity. In different months, the expression levels of Sc-GPH in the mantle and foot is the highest in August, at which time the glycogen content decreased, indicating that the expression of Sc-GPH seems to be driven by reproductive cycle of S. constricta. In “YL1” population, four SNPs related to glycogen content are screened in the coding region of Sc-GPH gene, and c.930T>C is further verified in Taizhou wild population, which provides a candidate marker for molecular marker assisted breeding of high glycogen S. constricta varieties.
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Key words:
- Sinonovacula constricta /
- glycogen phosphorylase /
- glycogen content /
- SNP /
- correlation analysis
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1. 引言
糖原是储存于动物肝脏、肌肉中的支链多糖，是一种易于储存、随时可用的葡萄糖储备[1]。糖原的存在既保证了机体的正常运行，又对维持能量动态平衡起着至关重要的作用。在海洋双壳贝类中，有些种类的糖原储存于特定囊泡细胞中，其含量的变化与配子发育、生长、繁殖、抗逆、风味等密切相关[2]。在滑项薄壳鸟蛤（Fulvia mutica）[3]、魁蚶（Scapharca broughtonii）[4]、缢蛏（Sinonovacula constricta）[5]等多种贝类的研究中发现，性腺成熟过程中糖原含量显著下降；在夏季不利的环境中，糖原含量高的贝类抵抗能力强、死亡率低[6]；在长牡蛎（Crassostrea gigas）[7]、缢蛏[8]中，高糖原含量能显著增加肉质的鲜味和口感。
糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase，GPH）是糖原分解过程中的关键酶，催化糖原的磷酸解反应[9]。GPH基因最早在家兔肌肉中发现，随后获得糖原磷酸化酶基因的cDNA序列[10-11]。在海水贝类中，已克隆获得长牡蛎和福建牡蛎（Crassostrea angulata）GPH基因的cDNA全长序列，并发现GPH基因表达水平与糖原含量变化有关[12-13]。此外，在长牡蛎GPH基因中筛查到了1个与糖原含量关联的SNP位点[14]。目前，尚未见对缢蛏糖原磷酸化酶基因的相关研究。
缢蛏广泛分布于我国沿海滩涂，是浙江、福建等省份的主养贝类[15]。不同季节缢蛏的营养物质、鲜味变化很大，一般春季3−6月最佳，与其糖原含量密切相关[16]，然而目前有关缢蛏糖原调控的分子机制尚不明晰。本研究克隆了缢蛏糖原磷酸化酶基因（Sc-GPH）cDNA全长，分析其在缢蛏不同组织和月份的表达水平，并筛选与糖原含量相关的SNP位点，为高糖原缢蛏的分子育种提供候选基因和标记。
2. 材料与方法
2.1 实验材料
以浙江宏野海产品有限公司养殖的缢蛏“甬乐1号”为材料，自2019年2月开始采集缢蛏样品（16月龄，壳长为（61.63±3.69）mm，壳宽为（15.28±2.35）mm，壳高为（19.53±2.26）mm，体重为（14.08±2.11）g），此后每两个月定时采样，样品均为同一批，直至12月采样结束。每次取样，随机选取12颗缢蛏，活体解剖取8个组织（足、外套膜、性腺、闭壳肌、肝胰腺、水管、鳃和唇瓣），经液氮速冻后保存于−80℃冰箱，用于糖原含量测定和RNA提取。
用于SNP分析的缢蛏群体分别为“甬乐1号”（YL1）和台州市野生群体（TZ），各取100颗个体的足肌，一部分用于RNA提取，一部分经真空冷冻干燥置于−20℃保存，用于糖原含量测定。
2.2 糖原含量分析
取缢蛏不同组织、不同月份及不同群体样品，按照南京建成生物研究所生产的肝/肌糖原检测试剂盒（A043）的说明书进行糖原含量的测定。冻干样品中加入碱液，100°C加热20 min进行皂化。冷却后，加入蒽酮−硫酸溶液进行反应后，在Spark多功能酶标仪（TECAN，瑞士）620 nm波长处测定吸光度。
2.3 Sc-GPH cDNA全长克隆
根据缢蛏转录组文库中获得的Sc-GPH转录本序列，设计3′-RACE和5′-RACE特异性引物（表1）。以成贝足中总RNA为模板，用SMART RACE 5′/3′试剂盒（Clontech，美国）合成cDNA第一条链。以cDNA第一链为模板进行3′-RACE和5′-RACE扩增，其产物用1%琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化后的PCR产物与pEASY®-T1克隆载体（全式金，北京）进行连接，接着转化到DH5α感受态细胞（全式金，北京）中，挑选阳性菌落送上海生工公司进行测序。
表 1 所用的引物及信息Table 1. The information of primers used in this experiment引物名称 引物序列（5′-3′） 用途 H3 AGTGAACAGATCTCCACCGCAGGCA Sc-GPH 3′-RACE扩增 H5 GCGGGATGACTTGAACCTACGGAT Sc-GPH 5′-RACE扩增 18S-F TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT qPCR 18S-R CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA qPCR H-Q-F ATCTACAACTCCCTCCTCTACCA qPCR H-Q-R GGCACATCTTAGCCCAAAG qPCR H-S-F AAAGACATTCAATCGCCACCT SNP筛选 H-S-R TTTCTGGATTTGGCTCACAACCC SNP筛选 2.4 Sc-GPH序列及系统进化分析
利用DNAMAN 6.6软件将所获得Sc-GPH的5′-RACE和3′-RACE片段序列与转录本拼接，获得cDNA全长；通过ORF Finder网站（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ ）预测基因的开放阅读框（Opean Reading Frame, ORF）及氨基酸序列；利用Expasy （https://web.expasy.org/compute_pi/ ）预测蛋白质的分子量和等电点、Signalp（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ）预测信号肽；用Smart（http://smart embl-heidelberg.de/ ）预测功能域；通过BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ）在线工具对Sc-GPH所编码的氨基酸序列进行相似性分析，并用DNAMAN 6.6软件进行多重序列比对；用MEGA 6.0软件邻接法构建系统进化树。2.5 实时荧光定量PCR分析
将缢蛏8个组织和不同月份缢蛏足、外套膜的cDNA稀释50倍作为模板，用18S rDNA基因作为内参基因，利用LightCycler® 480 （Roche，德国）荧光定量PCR仪进行实时定量PCR。反应体系（20 μL）：2×SYBR GreenⅠMaster （Roche，德国） 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL；反应程序：95°C预变性10 min，然后95°C 10 s、60°C 1 min，45个循环。为了保证荧光定量PCR的可靠性，每个样品做3个技术重复，每组做4个生物学重复，Sc-GPH的相对表达量按照2−ΔΔct法计算，并用平均值±标准差表示。数据通过SPSS 22.0软件进行方差分析，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。
2.6 糖原含量相关SNP的筛选
取缢蛏“甬乐1号”（YL1）和台州市野生群体（TZ） 2个群体各100颗的足肌，提取RNA并反转录合成cDNA。根据Sc-GPH cDNA序列，用Primer Premier 5软件设计引物H-S-F和H-S-R（表1），PCR扩增产物进行Sanger测序。使用MEGA 6.0软件进行序列比对，运用SPSS 22.0软件将得到SNP位点的基因型值与基因型值对应的糖原含量进行线性回归分析，将其中一种等位基因纯合子赋值为2，另一种等位基因纯合子基因型值赋值为0，杂合子赋值为1 [17]。
3. 结果
3.1 缢蛏糖原含量的组织差异和月份变化分析
取浙江缢蛏软体部糖原含量最高的4月份样品[17]的不同组织（鳃、闭壳肌、足、外套膜、肝胰腺、性腺、水管、唇瓣），用于糖原含量组织差异分析。结果显示，足和外套膜糖原含量分别为（103.1±8.3）mg/g和（111.0±10.5）mg/g，极显著高于除闭壳肌外的其他组织（p<0.01，图1A）。缢蛏足和外套膜周年的糖原含量测定结果表明，上半年的糖原含量显著高于下半年，从2月份逐渐增加，4月份达到峰值，足和外套膜糖原含量分别为（141.3±9.8）mg/g和（148.3±4.7）mg/g（p<0.01），随后逐渐下降至10月份的最低值，足和外套膜糖原含量分别为（13.0±1.2）mg/g和（15.3±1.6）mg/g（图1B）。
图 1 缢蛏不同组织（A）和不同月份足和外套膜（B）的糖原含量变化1. 鳃；2. 闭壳肌；3. 足；4. 外套膜；5. 肝胰腺；6. 性腺；7. 水管；8. 唇瓣；A中不同小写字母代表差异极显著（p<0.01）；B中同一组织不同字母代表差异极显著（p<0.01）Figure 1. Changes of glycogen content in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B) of Sinonovacula constricta1. Gill; 2. adductor muscle; 3. foot; 4. mantle; 5. hepatopancreas; 6. gonad; 7. siphon; 8. palp; different lowercases indicate extremely significant difference (p<0.01) in A; different letters marked on columns of the same tissue represent their extremely significant differences in data (p<0.01) in B3.2 Sc-GPH全长cDNA序列分析
Sc-GPH cDNA全长3 963 bp （GenBank登录号：MT125681），包括5′非编码区（Untranslated Region，UTR）112 bp、3′UTR 1 310 bp、开放阅读框2 541 bp，共编码846个氨基酸。预测其蛋白分子质量（Mw）为97.23 kDa，理论等电点（pI）为6.11；该蛋白质的氨基酸组成中，极性氨基酸所占比例较高，表现为亲水性，没有明显的信号肽；预测Sc-GPH蛋白在113～828 aa含有1个功能域，为Phosphorylase。
选取16种动物GPH氨基酸序列与Sc-GPH氨基酸序列作多重比对。结果发现，Sc-GPH与虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis，OWF50424.1）、欧洲大扇贝（Pecten maximus，XP_033734012.1）、长牡蛎（Crassostrea gigas，CCN27372.1）GPH的氨基酸序列相似性较高，分别为78.34%、78.11%和77.87%，与日本对虾（Penaeus japonicus，BAJ23879.1）、家蚕（Bombyx mori，ACB41088.1）、智人（Homo sapiens，NP_059125.2）等物种的相似性为70.45%～75.86%。系统进化树结果显示，缢蛏与欧洲大扇贝、虾夷扇贝、长牡蛎等贝类亲缘关系较近，聚为一支；与昆虫类、甲壳类、哺乳动物类亲缘关系较远（图2）。
图 2 缢蛏与其他物种GPH氨基酸序列系统进化分析进化树中各物种GPH氨基酸序列的GenBank登录号为：缢蛏（Sinonovacula constricta，MT125681）；长牡蛎（Crassostrea gigas，CCN27372）；欧洲大扇贝（Pecten maximus，XP_033734012）；虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis，OWF50424）；克氏原螯虾（Procambarus clarki，AVN99053）；凡纳滨对虾（Penaeus vannamei，QCY50320）；日本对虾（Procambarus clarkii，BAJ23879）；异色瓢虫（Harmonia axyridis，ASZ80181）；黑腹果蝇（Drosophila melanogaster，NP_001027219）；家蚕（Bombyx mori，ACB41088）；甜菜夜蛾（Spodoptera exigua，ACN78408）；亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis，AFO54708）；智人（Homo sapiens，AAC18079）；小家鼠（Mus musculus，AAG00588）；马（Equus caballus，BAH22533）；单峰驼（Camelus dromedarius，KAB1277008）Figure 2. Neighbor-joining phylogenetic tree of GPH among Sinonovacula constricta and other speciesGenBank accession numbers of GPH sequences used for phylogenetic tree: Razor clam （Sinonovacula constricta, MT125681）; Pacific oyster （Crassostrea gigas, CCN27372）; European scallop （Pecten maximus, XP_033734012）; Japanese scallop （Mizuhopecten yessoensis, OWF50424）; Red swamp crayfish （Procambarus clarki, AVN99053）; Whiteleg shrimp （Penaeus vannamei, QCY50320）; Kuruma prawn （Penaeus japonicus, BAJ23879）; Asian lady beetles （Harmonia axyridis, ASZ80181）; Fruit fly （Drosophila melanogaster, NP_001027219）; Domestic silkworm （Bombyx mori, ACB41088）; Beet armyworm （Spodoptera exigua, ACN78408）; Asiatic corn borer （Ostrinia furnacalis, AFO54708）; Human （Homo sapiens, AAC18079）; House mouse （Mus musculus, AAG00588）; Horse （Equus caballus, BAH22533）; Single hump camel （Camelus dromedarius, KAB1277008）3.3 不同组织、不同月份Sc-GPH的表达模式
取8月份缢蛏的不同组织样品，利用qRT-PCR检测Sc-GPH的组织表达特征，结果显示，Sc-GPH在8个组织均有表达，其中足、外套膜的表达量最高（p<0.01，图3A）。Sc-GPH在缢蛏不同月份外套膜和足的表达结果表明，Sc-GPH在8月的表达水平极显著高于其他月份（p<0.01，图3B）。
图 3 Sc-GPH在缢蛏不同组织（A）和不同月份足和外套膜（B）的的表达特征1. 鳃；2. 闭壳肌；3. 足；4. 外套膜；5. 肝胰腺；6. 性腺；7. 水管；8. 唇瓣；A中不同小写字母代表差异极显著（p<0.01）；B中同一组织不同字母代表差异极显著（p<0.01）Figure 3. The expression characteristics of Sc-GPH in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B)1. Gill; 2. adductor muscle; 3. foot; 4. mantle; 5. hepatopancreas; 6. gonad; 7. siphon; 8. palp; different lowercases indicate extremely significant difference（p<0.01）in A; different letters marked on columns of the same tissue represent their extremely significant differences in data （p<0.01）in B3.4 Sc-GPH SNP位点与糖原含量的关联分析
在缢蛏YL1群体中，Sc-GPH编码区域共发现33个SNP位点，其中4个位点（c.874C>T、c.930T>C、c.1133T>C、c.1284T>A）与糖原含量的相关性较为显著，c.1133T>C、c.1284T>A位点差异显著（p<0.05，表2）；在TZ群体同样筛选到c.930T>C位点（表2），且该位点为同义突变。在缢蛏两个群体中，c.930T>C位点与糖原含量相关性均为差异显著（p<0.05，表2），CC基因型个体的糖原含量比TT基因型的个体高（p<0.05），说明该位点与缢蛏糖原含量相关。
表 2 缢蛏“甬乐1号”（YL1）和台州野生群体（TZ）Sc-GPH SNPs位点与糖原含量的相关性分析Table 2. Association of SNPs of Sc-GPH with glycogen content in YL1 and TZ of Sinonovacula constricta群体 SNP位点 基因型 样本量/频率 糖原含量/(mg·g−1) p值 YL1 c.874C>T CC 89/0.89 54.6±30.3 0.047* CT 11/0.11 74.1±30.0 c.930T>C TT 49/0.49 52.1±29.4 0.029* TC 43/0.43 57.9±28.4 CC 8/0.08 78.6±34.7 c.1133 T>C TT 87/0.87 53.6±29.2 0.023* TC 13/0.13 77.7±27.1 c.1284 T>A TT 65/0.65 61.0±26.7 0.028* TA 23/0.23 56.8±37.7 AA 12/0.12 33.1±1.97 TZ c.930T>C TT 47/0.47 73.9±22.5 0.047* TC 40/0.4 80.7±23.2 CC 13/0.13 86.1±15.0 注：p值代表SNP位点与糖原含量的相关程度，*代差异显著（p<0.05）。 4. 讨论
糖原是一种可以直接利用的储能物质，包括储存于肌肉中的肌糖原和肝脏中的肝糖原。在哺乳动物中，骨骼肌中的肌糖原占身体糖原总量的2/3，肝脏中的肝糖原占糖原总量的1/3。研究发现，不同海洋贝类贮存糖原的部位不尽相同，如长牡蛎的糖原主要贮存于性腺、唇瓣中[12]，紫贻贝（Mytilus edulis）的糖原则贮存在外套膜中[18]，而墨西哥湾扇贝（Argopecten irradians concentricus）的糖原贮存在闭壳肌中，并因繁殖周期、环境而发生变化[19]。本研究发现，缢蛏足和外套膜组织的糖原含量高于其他组织，与Yan等[20]的研究结果基本一致，说明这两个组织是缢蛏糖原的主要贮存部位，它们具有较高的肌肉含量，肌糖原分解可为其收缩供给充足能量。另外，在缢蛏肝胰腺中亦有较高的糖原含量，推测主要存在于肝细胞中的肝糖原，其分解可以维持血糖浓度的恒定，从而保证机体的正常生理功能。
糖原代谢的多个调节过程，如葡萄糖的增加和糖原降解的减少，均可能由糖原磷酸化酶引起[21]。研究表明，糖原磷酸化酶激活催化糖原水解为葡萄糖，导致GPH基因表达量增加，从而为机体提供能量[22-23]。此外，GPH基因在不同发育时期和组织中均有表达，但表达量存在明显差异，如福建牡蛎GPH基因在性腺和闭壳肌中表达量较高[13]。本研究结果表明，在缢蛏8个组织中均检测到Sc-GPH的表达，其中足和外套膜呈现高表达，与其对应的高糖原含量及其存储糖原能力有关。在许多物种中发现，肌肉是活性糖原的储存库，以便快速提供ATP[24]。2−5月为缢蛏性腺发育的休止期，糖原含量较高，与此同时检测到Sc-GPH在足和外套膜中低表达，说明缢蛏体内正在合成储存糖原；随着配子的发生，Sc-GPH的表达量显著增加，而糖原含量降低，表明糖原储存向糖原分解转变。因此，Sc-GPH mRNA表达水平的变化与缢蛏繁殖周期关系紧密，其在配子发生期间可利用足和外套膜中的糖原。
多数SNP位于基因组的非编码区，在群体遗传和生物进化研究中起着重要作用[25-26]，而编码区的SNP位点则具有较高的遗传稳定性[27]。本实验在缢蛏Sc-GPH的编码区共检测到个33个SNP位点，SNP平均密度达到1/72 bp，这与缢蛏生长因子受体结合蛋白2基因外显子上 SNP平均密度（1/65 bp）[28]、长牡蛎糖原磷酸化酶基因外显子SNP平均密度（1/35 bp）[29]等存在差异，说明同一物种不同基因或不同物种之间SNP分布密度不同。在缢蛏Sc-GPH与糖原含量的关联分析中发现，1个SNP位点与糖原含量相关，c.930T>C位点的CC基因型个体的糖原含量比TT基因型的个体高，该位点可作为缢蛏高糖原遗传育种的重要候选分子标记。
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图 1 缢蛏不同组织（A）和不同月份足和外套膜（B）的糖原含量变化
1. 鳃；2. 闭壳肌；3. 足；4. 外套膜；5. 肝胰腺；6. 性腺；7. 水管；8. 唇瓣；A中不同小写字母代表差异极显著（p<0.01）；B中同一组织不同字母代表差异极显著（p<0.01）
Fig. 1 Changes of glycogen content in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B) of Sinonovacula constricta
1. Gill; 2. adductor muscle; 3. foot; 4. mantle; 5. hepatopancreas; 6. gonad; 7. siphon; 8. palp; different lowercases indicate extremely significant difference (p<0.01) in A; different letters marked on columns of the same tissue represent their extremely significant differences in data (p<0.01) in B
图 2 缢蛏与其他物种GPH氨基酸序列系统进化分析
进化树中各物种GPH氨基酸序列的GenBank登录号为：缢蛏（Sinonovacula constricta，MT125681）；长牡蛎（Crassostrea gigas，CCN27372）；欧洲大扇贝（Pecten maximus，XP_033734012）；虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis，OWF50424）；克氏原螯虾（Procambarus clarki，AVN99053）；凡纳滨对虾（Penaeus vannamei，QCY50320）；日本对虾（Procambarus clarkii，BAJ23879）；异色瓢虫（Harmonia axyridis，ASZ80181）；黑腹果蝇（Drosophila melanogaster，NP_001027219）；家蚕（Bombyx mori，ACB41088）；甜菜夜蛾（Spodoptera exigua，ACN78408）；亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis，AFO54708）；智人（Homo sapiens，AAC18079）；小家鼠（Mus musculus，AAG00588）；马（Equus caballus，BAH22533）；单峰驼（Camelus dromedarius，KAB1277008）
Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of GPH among Sinonovacula constricta and other species
GenBank accession numbers of GPH sequences used for phylogenetic tree: Razor clam （Sinonovacula constricta, MT125681）; Pacific oyster （Crassostrea gigas, CCN27372）; European scallop （Pecten maximus, XP_033734012）; Japanese scallop （Mizuhopecten yessoensis, OWF50424）; Red swamp crayfish （Procambarus clarki, AVN99053）; Whiteleg shrimp （Penaeus vannamei, QCY50320）; Kuruma prawn （Penaeus japonicus, BAJ23879）; Asian lady beetles （Harmonia axyridis, ASZ80181）; Fruit fly （Drosophila melanogaster, NP_001027219）; Domestic silkworm （Bombyx mori, ACB41088）; Beet armyworm （Spodoptera exigua, ACN78408）; Asiatic corn borer （Ostrinia furnacalis, AFO54708）; Human （Homo sapiens, AAC18079）; House mouse （Mus musculus, AAG00588）; Horse （Equus caballus, BAH22533）; Single hump camel （Camelus dromedarius, KAB1277008）
图 3 Sc-GPH在缢蛏不同组织（A）和不同月份足和外套膜（B）的的表达特征
1. 鳃；2. 闭壳肌；3. 足；4. 外套膜；5. 肝胰腺；6. 性腺；7. 水管；8. 唇瓣；A中不同小写字母代表差异极显著（p<0.01）；B中同一组织不同字母代表差异极显著（p<0.01）
Fig. 3 The expression characteristics of Sc-GPH in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B)
1. Gill; 2. adductor muscle; 3. foot; 4. mantle; 5. hepatopancreas; 6. gonad; 7. siphon; 8. palp; different lowercases indicate extremely significant difference（p<0.01）in A; different letters marked on columns of the same tissue represent their extremely significant differences in data （p<0.01）in B
表 1 所用的引物及信息
Tab. 1 The information of primers used in this experiment
引物名称 引物序列（5′-3′） 用途 H3 AGTGAACAGATCTCCACCGCAGGCA Sc-GPH 3′-RACE扩增 H5 GCGGGATGACTTGAACCTACGGAT Sc-GPH 5′-RACE扩增 18S-F TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT qPCR 18S-R CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA qPCR H-Q-F ATCTACAACTCCCTCCTCTACCA qPCR H-Q-R GGCACATCTTAGCCCAAAG qPCR H-S-F AAAGACATTCAATCGCCACCT SNP筛选 H-S-R TTTCTGGATTTGGCTCACAACCC SNP筛选 
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表 2 缢蛏“甬乐1号”（YL1）和台州野生群体（TZ）Sc-GPH SNPs位点与糖原含量的相关性分析
Tab. 2 Association of SNPs of Sc-GPH with glycogen content in YL1 and TZ of Sinonovacula constricta
群体 SNP位点 基因型 样本量/频率 糖原含量/(mg·g−1) p值 YL1 c.874C>T CC 89/0.89 54.6±30.3 0.047* CT 11/0.11 74.1±30.0 c.930T>C TT 49/0.49 52.1±29.4 0.029* TC 43/0.43 57.9±28.4 CC 8/0.08 78.6±34.7 c.1133 T>C TT 87/0.87 53.6±29.2 0.023* TC 13/0.13 77.7±27.1 c.1284 T>A TT 65/0.65 61.0±26.7 0.028* TA 23/0.23 56.8±37.7 AA 12/0.12 33.1±1.97 TZ c.930T>C TT 47/0.47 73.9±22.5 0.047* TC 40/0.4 80.7±23.2 CC 13/0.13 86.1±15.0 注：p值代表SNP位点与糖原含量的相关程度，*代差异显著（p<0.05）。
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